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化妆品中马兜铃酸的检测
2018-10-22 11:45

2.1 前言


2.1.1 马兜铃酸性质

      马兜铃酸是一大类硝基菲类有机酸化合物,包括马兜铃酸 A、B、C、D以及马兜铃内酞胺等等。存在于马兜铃属及细辛属等马兜铃科植物中,而这些植物曾广泛地被中医作为原生药材入药,依靠吸食这类植物生存的蝴蝶体内也有马兜铃酸。


2.1.2 马兜铃酸结构



图2-1  马兜铃酸结构式


2.1.3 马兜铃酸危害

      马兜铃酸类化合物中,主要的毒性成分为马兜铃酸A或其代谢物马兜铃内酞胺,硝基是马兜铃酸类衍生物中最主要的毒性基团,此外甲氧基和羟基的存在可以使马兜铃酸的毒性进一步加强。另有研究发现,不但马兜铃酸具有很强的肾毒性,其代谢产物马兜铃内酰胺同样具有肾毒性。又通过对马兜铃酸代谢过程及代谢酶的研究证实,马兜铃酸可使RAS基因和P53基因发生突变,进而诱发肿瘤。因此需要对马兜铃酸进行进行检测。


2.1.4 检测方法

      大连依利特分析仪器有限公司结合GB/T 35949-2018《化妆品中禁用物质米马兜铃酸A的测定高效液相色谱法》提出了针对膏霜、乳液、化妆水等皮肤护理类化妆品中马兜铃酸A分析的全套解决方案。相关人员可参考本实验中的方法,进行化妆品中马兜铃酸A的测定。





2.2 仪器设备与试剂



2-1(a)  EClassical 3100型高效液相色谱系统设备标准配置清单

序号

名称

数量

订货号

1

UV3100紫外-可见检测器

1

31020023

2

P3100高压恒流泵

1

31010047

3

O3100色谱柱恒温箱(选配)

1

31040010

4

Rheodyne 7725i高压六通进样阀

1

32027725i

5

ZJ-1阀支架

1

18050004

6

Chromsoft色谱数据工作站

1

 

7

TD-1-15梯度混合器(选配)

1

31060001

8

TP3100溶剂托盘

1

 

9

SupersilODS2 5μm4.6×250mm色谱柱

1

 

10

S3100自动进样器(选配)

1

31090005

11

DG3100在线脱气机(选配)

1

31050006


2-1(b)  iChrom 5100型高效液相色谱系统设备标准配置清单

序号

名称

数量

订货号

1

D5101紫外-可见检测器

1

31020022

2

P5101高压恒流泵

1

31010041

3

O5100色谱柱恒温箱(选配)

1

31040009

4

Rheodyne 7725i高压六通进样阀

1

32027725i

5

VB5101阀支架

1

18050012

6

Chromsoft色谱数据工作站

1

 

7

M5101系统组织器

1

31080009

8

AD适配器

1

31030024

9

Supersil ODS25μm4.6×250mm色谱柱

1

 

10

S5101自动进样器(选配)

1

31090004

 

P5102高压恒流泵(选配)

 

 

11

M5102系统组织器(选配)

1

31080010

                     注:或同等配置的其他型号的高效液相色谱仪

 

2-2 主要化学试剂、标准品清单

序号

试剂

纯度

1

甲醇

色谱纯

2

去离子水

18.2MΩ

3

冰醋酸

分析纯

4

马兜铃酸A

阿拉丁


2-3  主要样品前处理设备

序号

名称

规格型号

备注

1

溶剂过滤器

1000mL

流动相过滤

2

隔膜真空泵

0.08MPa,160W

流动相过滤,GM-0.33A

3

超声清洗器

3L/6L, 40/60KHz, 120W

流动相脱气,AS3120

4

精密电子天平

感量为万分之一

称量

5

离心机

3K-15

SIGMA


实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、移液枪(0~1000µL,0~5000µL)、移液枪枪头(1mL,5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、进样针、滤膜等若干。





2.3 实验方法


2.3.1 标准溶液配制

      马兜铃酸A标准储备液(100μg/mL):取马兜铃酸标准品约5mg置于50mL容量瓶中,用甲醇定容。

      马兜铃酸A标准工作液:用流动相配制浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的马兜铃酸A标准工作液。


2.3.2 样品前处理

      称取化妆品约1.0g(精确至0.0001g),置于50mL离心管中,精密加入甲醇10mL,超声提取20min,5000r/min离心15min后,上清液经0.45µm微孔滤膜过滤,备用。


2.3.3 色谱条件

      流动相:甲醇:0.5%冰醋酸水溶液=70:30(V:V)

      色谱柱:Supersil ODS2 5μm 4.6×200mm

      流速:1.0mL/min

      检测波长:315nm

      进样量:20µL

      柱温:30℃





2.4 实验结果


2.4.1. 典型分离色谱图


进样分析浓度为20μg/mL的马兜铃酸A标准工作液,使用2.3.3中的色谱条件,结果如下图所示。


图2-4  马兜铃酸A标准溶液色谱图


2-4  色谱参数

物质

保留时间(min)

峰面积(mV.sec)

不对称度

塔板数(N/m)

马兜铃酸A

11.35

1039.77

1.18

43600

                       从以上结果可知,马兜铃酸A分析速度快,不对称度好,柱效高,故该方法适合于马兜铃酸A的分析。




2.4.2. 线性与检出限


将马兜铃酸A标准工作溶液,按2.3.3中色谱条件进行分析,马兜铃酸的线性方程及检出限如下表所示。


2-5  线性方程

物质

线性方程

线性相关系数R

马兜铃酸A

y =53.7433x -18.1652

0.9999

                              从上表可知,马兜铃酸A浓度在1.0μg/mL到50μg/mL线性范围内线性相关系数大于0.999。

                    以3倍信噪比对应的浓度换算为仪器的检出限,以10倍信噪比对应的浓度为仪器的定量限,结果如下表所示。



2-6  检出限对比

 

方法检出限(mg /kg)

方法定量限(mg /kg)

GB/T 35849-2018检出限(mg/kg)

GB/T 35949-2018定量限(mg/kg)

马兜铃酸A

0.29

0.96

0.30

1.00

                        从以上结果可知,本系统的马兜铃酸A检测的灵敏度明符合国标中的要求,即符合检测要求。




2.4.3. 方法准确性与重复性


在添加浓度5.0μg/mL~20.0μg/mL的浓度范围内,测得回收率82.3%~90.6%,相对标准偏差为1.3%~2.9%。


2-7  化妆品中马兜铃酸A方法准确性与重复性结果

加标浓度g/mL)

平行样品

实测值(μg/mL

加标回收率(%)

重复性(RSD%)

5.0

1

4.36

87.1

2.9

2

4.19

83.8

3

4.12

82.3

20.0

1

18.13

90.6

1.3

2

17.68

88.4

3

18.07

90.4

 




2.4.4. 实际样品


市场购化妆品,按本文中提到的方法进行了分析,结果如下所示。


图2-5  实际样品谱图

 

2-7  实际样品

马兜铃酸A

浓度(mg/L)

含量(mg/kg)

化妆品

未检出

未检出

 



2.5 参考文献


      [1]GB/T 35949-2018《化妆品中禁用物质米马兜铃酸A的测定高效液相色谱法》。






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