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核酸引物的纯化及HPLC检测方法
2021-12-09 15:25

       核酸引物是指人工合成的两段寡核苷酸序列,一段与目的基因一端的一条DNA模板链互补,另一段与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。它是DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点,所以引物的纯度关系到PCR扩增的结果,尤其是对用于测序、克隆的引物。因此引物合成之后一般都需要做进一步的纯化。


核酸引物纯化

核酸引物纯化现在引物纯化方式有很多种,目前常见的主要有C18柱脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化以及HPLC纯化等,各纯化方式对比如下

纯化方式

纯化特点

C18柱脱盐

对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。

该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

RPC纯化

RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。但它是一种有效且更加经济的纯化方式。该纯化方法对引物长度为15~40mer更为适用。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。

ePAGE纯化

ePAGE是一种利用快速电泳对引物进行分离纯化的方法,具有通量大,速度快的特点。依靠全自动进样,快速电泳,自动纯化等设备,短时间内完成DNA条带的分离纯化。该纯化方法对<15 mer和>60me的引物不适用。但纯度可满足大多分子生物学实验需求。

PAGE纯化

PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。

HPLC纯化

HPLC纯化是利用高效液相色谱的原理,对引物DNA进行纯化。该方法能达到很高的纯度和灵敏度。该法的缺点是成本较高,批量生产效率不高。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。

在使用HPLC方法对引物DNA的分析和纯化中,常用的有离子交换(ion-exchange)HPLC和反相HPLC。反相HPLC一般纯度能大于90%;离子交换 HPLC纯度能大于95%,并且可以有效的去除N-1短片段,对纯化短链引物<15mer特别有效。

依利特最近推出的核酸纯化系统,是一套多功能制备系统,流量范围可达100mL/min,同时具备双波长检测功能,可实现进样和收集同时进行,兼容多种规格托盘和试管。与之相匹配的SinoPak BEH T-C18 反相色谱柱以及Bioassist 阴离子交换柱,纯化效率高,色谱柱寿命长,是核酸纯化的不二之选。


核酸引物纯度检测

纯化完成后,引物纯度检测也是必备的一个步骤。HPLC是最常用的一种分析方法,参考国标GB/T 34797-2017,核酸引物纯度的分析色谱条件如下:

色谱柱:

SinoPak BEH AQ-C18 色谱柱 3μm 4.6*50mm

流动相:A:0.1mol/L TEAA;B:乙腈,梯度洗脱

0-15min 流动相B从5%到30%

检测波长:260nm

流速:1.0mL/min

柱温:60℃

SinoPak BEH AQ-C18色谱柱是依利特最新研发并推出的全新一代杂化硅胶色谱柱,通过特殊的三键键合工艺,极大降低键合相脱落。该色谱柱不但可以耐纯水,在具备高的柱效和机械强度的同时,还具有很宽pH范围稳定性,即使在极端的条件下,也能保持很好的柱寿命。SinoPak BEH AQ-C18色谱柱有三种不同的孔径[130Å、200Å和300Å] ,适用于从小分子分析到大分子生物制药分析的各类应用。


分析纯化系统配置如下

序号

设备型号

主要参数

1

P3170

高压恒流泵

流速范围:0.01~100.00mL/min

耐压:30MPa

2

UV3150

双波长紫外-

可见检测器

分析型:10mm

半制备型:2mm

制备型:0.5~2mm可调

3

S3150PF

自动进馏器

进样范围:10μL~20mL(最大可达25mL)

强制、时间、阈值、斜率等多种收集模式

4

TP3100溶剂托盘

/

5

Kromstation

色谱数据工作站

可对仪器进行全反控

6

Bioassist Q

分析型

阴离子交换柱

10µm 4.6×50mm

Bioassist Q

制备型

阴离子交换柱

13µm 10×100mm

SinoPak BEH AQ-C18

3µm 4.6×50mm (分析型)

SinoPak BEH AQ-C18

5µm 10×250mm (制备型)


其他详情,请拨打400-66-35483电话咨询或详询当地销售经理。


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