在药品研发、食品安全、环境监测和化工分析等领域，高效液相色谱仪（HPLC） 是进行精准定量分析的“黄金标准”工具。无论是检测药品的有效成分，还是分析食品中的添加剂含量，其终的含量测定结果都至关重要。本文将深入浅出地解析HPLC含量测定的核心原理、关键计算公式，并解答三个令实验人员头疼的实战问题，助您夯实基础，提升分析效率与准确性。

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一、核心原理：分离与比较的艺术

HPLC含量测定本质上是一个 “先分离，后比较” 的过程。

高效分离：待测样品经进样器进入色谱柱。由于各组分在流动相（液体）和固定相（柱内填料）间的分配能力不同，在高压泵送的流动相带动下，各组分以不同速度迁移，从而实现高精度分离。

精准检测：流出色谱柱的组分进入检测器（如紫外检测器），其浓度信号被转化为电信号，形成一个个色谱峰。

定量依据：这是定量的基石——在一定浓度范围内，组分的峰面积（A）或峰高（h）与其浓度（c）成正比。通过与已知浓度的标准品（对照品）进行比较，即可计算出未知样品的含量。

二、两大经典方法及计算公式详解

1. 外标法——直接的对比法

原理：直接用样品中待测组分的信号与对照品的信号进行比较。

单点校正公式（适用于浓度接近时）：

含量（%）= (A样 / A对) × (c对 / c样) × 100%

（A：峰面积；c：溶液浓度）

标准曲线法（更通用、更准确）：

首先用一系列不同浓度的对照品绘制标准曲线（线性方程：y = ax + b，y为峰面积，x为浓度）。将样品的峰面积代入，求得其溶液浓度c样测，再通过下式计算：

含量（%）= (c样测 × V × D / W) × 100%

（V：样品定容体积；D：稀释倍数；W：样品称样量）

2. 内标法——抵消误差的精密法

原理：在样品和对照品中加入已知量、性质接近的内标物，通过比较待测物与内标物的峰面积比值来定量。此法可有效抵消进样误差和前处理损失。

核心公式：

先由对照品求校正因子 F = (A内标对 / A对) × (c对 / c内标)

再计算样品含量 含量（%）= F × (A样 / A内标样) × (c内标 / c样) × 100%

掌握HPLC含量测定的原理与计算，并深刻理解实验中的关键细节和常见问题，是获得可靠数据的前提。无论您是分析新手还是经验丰富的工程师，从精准的样品前处理、严谨的标准曲线建立，到对仪器状态的敏锐洞察，每一步都决定着分析的成功与否。希望本文能成为您HPLC定量分析工作中的实用指南，助您攻克难关，让每一次检测都精准无误。

表1.HPLC含量测定两大经典定量方法对比

表2.HPLC含量测定核心计算公式汇总

表3.HPLC含量测定关键操作质量控制点

实战中必知的3个常见问题（Q&A）

Q1：标准曲线在高浓度点不呈线性了，怎么办？

A：这通常是检测器响应饱和或色谱柱过载的信号。解决方案：首先将样品溶液适当稀释，使其落入线性范围。同时，重新评估并建立覆盖实际样品浓度的标准曲线范围。确保仪器状态良好，必要时可验证非线性拟合的适用性。

Q2：峰面积重现性差（RSD超标），如何系统排查？

A：这是多因素问题，建议按以下顺序排查：

首要检查进样系统：自动进样器针头是否堵塞或有气泡？手动进样操作是否规范？

检查样品溶液：是否稳定？是否完全溶解、过滤？现配现用。

确认色谱系统稳定性：泵流速是否稳定？检测器（尤其是紫外灯）能量是否充足？柱温是否恒定？

复核积分参数：确保色谱数据处理软件中的积分方法设置一致、合理。

Q3：外标法中，样品前处理的“定容”体积不准，影响大吗？

A：影响巨大且是直接影响。从公式 含量（%）= (c样测 × V × D / W) × 100% 可见，定容体积（V）与计算结果成正比。例如，100mL定成99mL，结果就会产生约1%的正偏差。关键操作：务必使用经过校准的A级容量瓶，并严格按照“液面凹缘与刻度线相切”的要求进行定容，这是保证数据准确的生命线。

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