不管是实验室新手还是常年和仪器打交道的老手，想要让液相色谱仪始终保持稳定的工作状态、测出准确可靠的数据，每一个操作细节都不能马虎。下面这些使用要求和规范，都是从日常实操经验里总结出来的，跟着做既能保护仪器，也能少走很多弯路。​

一、环境与基础准备​

仪器就像人一样，也需要舒服的 “工作环境”。得把它放在平稳、没有振动的工作台上，远离暖气、烘箱这些热源，也别让阳光直接晒着 —— 温度忽高忽低、环境乱糟糟的，很容易影响检测结果。一般来说，环境温度控制在 15-30℃，湿度符合仪器说明书要求，平时多擦擦工作台，保持周围干净，仪器才能 “心情好” 地干活。​

电源和接地更是不能大意。一定要用稳定的电源，要是电压总波动，不仅数据会飘，还可能伤仪器。另外，良好的接地必不可少，这不仅是为了防止操作时触电，还能避免电磁干扰导致的数据不稳定，毕竟安全和准确都是第一位的。​

小结常见问题

Q1：空调直吹液相仪器会不会造成数据异常？

A：禁止空调出风口直吹仪器，局部骤冷会引发基线漂移、保留时间波动，仪器远离空调风口摆放。

Q2：普通家用插排能否代替稳压电源给液相供电？

A：不可以，液相属于精密分析设备，必须配备专用稳压电源，禁止与烘箱、高速离心机共用插座。

Q3：周边设备震动影响液相怎么办？

A：仪器底部加装减震脚垫，离心机等震动设备分区安置，规避震动带来的泵压不稳问题。

表1.环境与基础准备要求​

相关产品推荐：1、高效液相色谱仪  2、超高效液相色谱仪  3、制备液相色谱仪  4、专用液相色谱仪

二、流动相（溶剂）准备​

流动相是液相色谱仪的 “血液”，质量过关才能让检测顺畅。溶剂和试剂必须用 HPLC 级或者更高级别的，别为了省点成本用低级别的，后数据不准反而白忙活。​

水相得用新鲜制备的超纯水，电阻值要达到 18.2 MΩ・cm 才行 —— 放久了的纯水容易滋生细菌、混入杂质，会堵塞管路和色谱柱。​

所有流动相用之前，都得用 0.22μm 或者 0.45μm 的微孔滤膜过滤一遍，把里面的颗粒杂质滤掉，不然这些小颗粒会像 “沙子” 一样，磨损泵头、堵色谱柱，后续修起来既费钱又费时间。​

过滤后的流动相还得脱气，常用的超声波脱气或者在线脱气机都可以。脱气后别着急用，等它恢复到室温再用，不然温度差异会让流动相里又产生小气泡，影响输液稳定性。​

关于缓冲盐，有两个点一定要记牢：一是尽量别用容易在有机相里析出的盐（比如磷酸盐），而且有机相的比例也不能太高，不然盐析出来会堵管路；二是缓冲盐溶液好现配现用，别想着一次配很多存起来，放久了容易长菌，到时候不仅污染系统，还会影响检测结果。至于怎么保护泵和色谱柱，后面的清洗规程里会详细说。​

小结常见问题

Q1：超纯水放置隔夜后还能配制流动相吗？

A：超纯水取出后 24h 内用完，隔夜水质下降、滋生微生物，严禁用于 HPLC 流动相配制。

Q2：水系滤膜过滤甲醇会有什么问题？

A：水系滤膜不耐纯有机试剂，遇甲醇溶解破损；水相用水系滤膜、甲醇 / 乙腈等有机相使用有机尼龙滤膜。

Q3：磷酸盐缓冲液常温能存放多久？

A：常温储存不超 12h，4℃冷藏长 3 天，过期易长菌堵管路。

Q4：流动相超声脱气标准时长？

A：常规超声 10～20min，搭配在线脱气机可进一步降低气泡干扰。

表2.流动相（溶剂）准备规范

三、泵与输液系统​

给泵选流动相，首先要考虑溶剂相容性。千万别用纯乙腈这类纯有机相当流动相，很容易让单向阀粘住，导致泵吸不上液，到时候仪器 “罢工”，还得拆泵维修。一般建议水相比例不低于 5%，这样能减少单向阀出问题的概率。​

气泡是泵和输液系统的 “大敌”，必须提前预防、及时排除。输液前一定要把流动相充分脱气，要是发现管路里有气泡，赶紧用注射器抽吸把气泡赶出去；如果泵压力不稳、流速也不稳定，大概率是泵里进了气泡，这时候执行灌注 /purge 操作就能解决。​

更换流动相时，要是两种流动相不互溶（比如从正己烷换到甲醇），可不能直接换，必须用异丙醇这类中间溶剂过渡冲洗，不然盐或者强极性物质会析出，堵在管路里。另外，每次实验结束后，只要用了缓冲盐，一定要马上执行清洗程序，别等液体干了再洗，到时候盐分结块就难清理了。​

小结常见问题：

Q1：长期只用 100% 乙腈运行，单向阀粘死怎么急救？

A：拆下单向阀，异丙醇常温超声 15min 修复，日常避免纯有机相长时间走样。

Q2：正己烷直接切换甲醇需要过渡溶剂吗？

A：必须用异丙醇低速冲洗管路过渡，直接换溶剂易析出杂质堵塞管路。

Q3：Purge 排气流速设置多少合适？

A：排气流速 3～5mL/min，气泡难排出可从溶剂入口反向抽液排气。

表3.泵与输液系统操作要点

四、色谱柱使用与维护​

色谱柱是液相色谱仪的 “核心部件”，用的时候得严格按照说明书来。首先是 pH 耐受范围，大部分色谱柱的 pH 范围在 2-8，特殊色谱柱可能会宽一点，千万不能往里面注射强酸、强碱样品，尤其是 pH>8 的碱性样品，很容易破坏色谱柱的固定相，缩短使用寿命。​

操作压力也得注意，不能超过色谱柱和仪器的大耐受压力。要是发现压力突然异常升高，别继续用了，这通常是堵塞的征兆，得赶紧排查原因，不然会把色谱柱压坏。​

柱温箱要保持恒定温度，温度稳定了，分析结果的重现性才好，不然每次测出来的数据都不一样，根本没法用。​

新色谱柱或者更换流动相后，得用新流动相充分平衡，一般需要 10-20 倍柱体积，直到基线平稳了才能开始检测，不然数据会不准。​

如果色谱柱长期不用，一定要按照说明书的要求清洗和保存。反相柱通常保存在甲醇或乙腈里，正相柱保存在正己烷里，有一点要记住：绝对不能用纯水保存色谱柱，纯水会让固定相水解，还容易长菌。​

另外，建议在分析柱前面加装保护柱，尤其是处理复杂样品的时候，保护柱能挡住大部分杂质，延长分析柱的寿命，毕竟一根分析柱可不便宜，能省则省。​

小结常见问题

Q1：C18 色谱柱闲置用甲醇还是乙腈保存？纯水浸泡一晚柱子会报废吗？

A：常规 80% 甲醇水溶液封存 C18 柱，严禁纯水长时间浸泡，容易造成填料水解柱效衰减。

Q2：样品 pH 超出色谱柱耐受区间如何应急处理？

A：立即低流速 5% 甲醇水冲柱 30min，后续调整样品 pH 或更换耐酸碱专用色谱柱。

Q3：保护柱更换周期多久？

A：常规样品 1～3 个月更换，中药、生物大分子样品建议每月更换。

Q4：新色谱柱平衡需要多少柱体积流动相？

A：10～20 倍柱体积流动相平衡，基线不稳多为脱气不足、柱温波动导致。

表4.色谱柱使用与维护标准

五、进样系统​

进样前的样品准备很关键，样品溶液必须澄清，得用 0.22μm 或者 0.45μm 的滤膜过滤，而且要注意滤膜材质和流动相的滤膜区分开，别混用。要是样品里有杂质颗粒，会堵进样针和色谱柱，到时候不仅要换配件，还得重新做实验。​

溶解样品的溶剂也有讲究，尽量用流动相或者比流动相弱的溶剂，要是用了强溶剂，容易出现溶剂效应，导致峰形畸变，影响定量结果。​

每次做完样品分析，一定要把进样器清洗干净，包括进样针的内外壁，都要用溶解样品的溶剂充分冲洗，不然样品残留会污染下一个样品，导致数据交叉污染，之前的实验可能就白做了。​

还有些样品是绝对不能直接进样的，比如蛋白质、血液、组织匀浆这类生物样品，以及含有不溶性颗粒的样品。这些样品必须先做前处理，比如蛋白沉淀、萃取、离心、过滤，处理干净后才能进样，不然会对仪器造成严重损害。​

小结常见问题

Q1：样品不过滤直接进样有什么危害？

A：杂质堵塞六通阀、保护柱，出现峰形变差、系统高压报警。

Q2：有机溶剂溶解水样出现峰分叉怎么解决？

A：属于溶剂效应，更换流动相作为样品溶剂，适当缩减进样体积。

Q3：血清类生物样品如何前处理进液相？

A：乙腈沉淀蛋白→高速离心→取上清过滤后上机。

表5.常见故障排查指引

六、检测器​

检测器里的流通池，是保证数据准确的关键部件，一定要保持清洁。平时很多时候基线不稳、数据不准，都是因为流通池被污染了 —— 要么是缓冲盐析出，要么是样品残留，所以每次用完后，一定要按照规程清洗流通池。​

对于紫外检测器这类有灯源的检测器，要注意延长灯的使用寿命。别没事就开关灯，仪器不用的时候，按照规程关掉灯就行，频繁开关会缩短灯的寿命，换一根灯也不便宜，能省则省。​

小结常见问题

Q1：缓冲盐用完冲洗时间不足有什么隐患？

A：盐分结晶卡在泵头、管路、柱头，引发堵柱、压力飙升。

Q2：关机顺序错乱先关泵再关灯有影响吗？

A：流通池残留溶剂干涸结晶，划伤检测器透光窗口。

表6.进样系统操作规范

七、系统清洗与关机​

用含缓冲盐的流动相做完实验后，清洗步骤绝对不能偷懒，一定要马上执行以下程序：先用去离子水（或者 5-10% 的甲醇水）低速冲洗管路和色谱柱，至少冲 30-60 分钟，把里面的盐分彻底冲干净；然后再用甲醇或乙腈高速冲洗 40 分钟以上，把水相置换出来，同时洗掉系统里的有机残留。要是不彻底清洗，盐分在管路里结块，下次开机就会堵，到时候清理起来更麻烦。​

整体关机的时候，先把系统流速降到零，然后关掉检测器灯，接着关泵和软件，后断开电源。一步一步来，别着急，这样能保护仪器的各个部件，延长整体使用寿命。​

小结常见问题：

Q1：缓冲盐用完冲洗时间不足有什么隐患？

A：盐分结晶卡在泵头、管路、柱头，引发堵柱、压力飙升。

Q2：关机顺序错乱先关泵再关灯有影响吗？

A：流通池残留溶剂干涸结晶，划伤检测器透光窗口。

八、故障预防与排查​

平时多注意预防，能少出很多故障。要是遇到压力过高（大概率是堵塞了），可以按照这个顺序检查和清洗：先检查保护柱，该换就换、该洗就洗；然后是混合器里的在线过滤器，拆下来清洗干净；接着是管路过滤器，同样检查清洗；后是泵头单向阀，要是堵了，用异丙醇冲洗，或者放超声波里用异丙醇清洗，要是无机物堵塞，还能用 10% 的稀硝酸清洗。​

要是遇到压力过低或者没压力，先看看流动相是不是用完了，管路接口有没有漏液；要是都没问题，可能是泵里进了大量气泡，执行灌注程序就能解决。​

要是基线噪音大或者漂移，先检查流动相是不是新鲜的、有没有充分脱气；然后看看检测器灯的能量够不够，是不是快到寿命了；再检查柱温是不是稳定，有没有忽高忽低；后看看流通池是不是被污染了，要是污染了赶紧清洗。​

其实只要跟着上面这些要求和规范操作，液相色谱仪就能一直保持佳工作状态，测出来的数据可靠，仪器和色谱柱的寿命也能显著延长，既省心又省钱。

液相色谱日常高频问答

Q1：使用过的流动相可以回收重复使用吗？

A：不建议回收，废液内含样品杂质与分解产物，复用易污染色谱柱。

Q2：甲醇与乙腈作为流动相区别是什么？

A：乙腈粘度低、洗脱力强，甲醇极性更高，依据样品极性选用，不可随意互换配比。

Q3：柱压缓慢持续升高是什么原因？

A：杂质逐步堆积在保护柱柱头，定期更换保护柱即可预防。

Q4：常规检测柱温箱设置多少摄氏度？

A：通用 25～30℃，国标 / 药典方法按照标准设定。

Q5：六通阀阀芯卡死怎么处理？

A：对应溶剂浸泡阀芯，禁止强行拧动旋钮。

Q6：不达标的低纯度超纯水能用在液相配液吗？

A：电阻率不足 18.2MΩ・cm 无法配制流动相，仅可清洗器皿。

Q7：梯度洗脱结束需要高有机相冲柱吗？

A：需要，高比例有机相洗脱强吸附杂质，保护色谱柱头。

Q8：液相仪器需要放置在通风区域吗？

A：甲醇、乙腈易挥发，仪器尽量在通风环境摆放，降低有机溶剂吸入风险。

Q9：新色谱柱到货如何验收？

A：标准品上机，对比理论塔板数、拖尾因子与出厂参数。

Q10：同方法换不同品牌 C18 柱保留时间偏移正常吗？

A：填料键合工艺不同会出现偏移，微调有机相比例优化分离。

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